176 prevenzione e nel trattamento delle complicanze virali dopo TCSE aploidentico T-depletato, sia in ambito pediatrico sia nel paziente adulto, con un rischio limitato di sviluppare GvHD (12,13). Inizialmente, i protocolli per la produzione di linfociti T virus-specifici (VST) erano basati su complesse procedure di stimolazione ed espansione in vitro, che risultavano in un prodotto finale composto da cellule T policlonali con ampia specificità. I principali vantaggi dell’espansione tramite coltura consistono nella possibilità di ottenere un numero sufficiente di VST da donatori con bassa frequenza di linfociti T della memoria per un dato antigene e nella riduzione dell'alloreattività residua dovuta alla selezione di cellule virus-specifiche a svantaggio di linfociti responsivi ad alloantigeni. Gli svantaggi di questo approccio sono rappresentati dai lunghi tempi di produzione, che possono arrivare anche a 3-8 settimane, limitandone l'utilità in pazienti con necessità cliniche urgenti e dalla teorica possibilità di indurre un progressivo esaurimento delle capacità replicative e funzionali cellulari. Tuttavia quest'ultimo limite non sembra essere un ostacolo importante, poiché i linfociti T EBV-specifici del donatore coltivati per 4-6 settimane sono stati in grado di ricostituire il pool delle cellule T della memoria nei pazienti trapiantati e sono stati rilevati fino a 9 anni dopo l’infusione in pazienti con riattivazione virale (17). La disponibilità di pool di peptidi virus-specifici sintetici, e progressi nelle tecniche e nei reagenti/materiali utilizzati ha consentito di ridurre il tempo di produzione, portandolo a meno di due settimane (18). Una valida alternativa alla coltura cellulare è la selezione diretta di linfociti T patogeno-specifici utilizzando multimeri costituiti da molecole HLA di classe I e peptidi virali coniugati con microsfere magnetiche, o la stimolazione con peptidi virali seguita da cattura delle cellule IFN gamma-positive con microsfere magnetiche. Quest'ultimo ha un importante vantaggio rispetto alla tecnica con i multimeri, poiché consente, oltre alla selezione di linfociti T CD8+ anche la presenza di popolazioni cellulari CD4+, con garanzia di una protezione immunitaria prolungata (19). La selezione diretta consente una rapida produzione di VST, ma è generalmente fattibile solo per quegli agenti patogeni che inducono un ampio pool di cellule T della memoria, come CMV o EBV, e richiede una procedura leucaferetica per ottenere materiale cellulare di partenza. Inoltre, non è un'opzione percorribile per i soggetti virus-naïve. 2.3.Linfociti T patogeno-specifici: risultati clinici per CMV, EBV, e ADV Dai primi studi clinici per EBV e CMV, l'uso profilattico, pre-emptive e terapeutico della terapia cellulare anti-infettiva si è molto ampliato, grazie agli alti tassi di risposta riportati e della bassa tossicità. L'efficacia della terapia cellulare adottiva virus-specifica è stata difficile da valutare, a causa della difficoltà di condurre ampi studi clinici multicentrici prospettici e dell'eterogeneità del disegno sperimentale, delle caratteristiche del prodotto cellulare e delle coorti arruolate negli studi clinici pubblicati. Tuttavia, la profilassi e/o trattamento pre-emptive delle EBV-PTLD post-TCSE ha mostrato un tasso di risposta superiore al 95% nei 107 pazienti trattati con VST a singola specificità espansi per coltura (10,17,20). Il trattamento della malattia conclamata ha avuto successo in oltre l'80% dei pazienti trattati per PTLD (20,21) o viremia/malattia da CMV (22,23), con scarsa tossicità limitata quasi esclusivamente allo sviluppo di GvHD nell’1-10% dei casi. L’incidenza di GvHD è risultata generalmente inferiore nei pazienti trattati per infezione/malattia da EBV, probabilmente a causa di una prevalenza di cellule T CD8+ nei CTL EBV-specifici, rispetto a una porzione maggiore di cellule T CD4+ presenti nelle linee cellulari CMV-specifiche. Prodotti cellulari ottenuti per selezione diretta, impiegati in studi più recenti, si sono dimostrati ugualmente efficaci nella ricostituzione dell'immunità post-trapianto, ma la risposta clinica è stata leggermente inferiore, pari rispettivamente al 60% nei pazienti con PTLD (24) e 70% nei pazienti trattati per riattivazioni da CMV (25) o ADV (26). Inoltre, l'incidenza di GvHD di nuova insorgenza o la riesacerbazione di GvHD pregressa è risultata superiore al 15%, probabilmente a causa di cellule T residue, potenzialmente alloreattive, nel prodotto. Tuttavia, data la mancanza di studi controllati, i dati di efficacia e sicurezza riportati dalle diverse strategie non sono propriamente confrontabili. 2.4. Linfociti T patogeno-specifici: risultati clinici preliminari per Polyomavirus e HHV6 La terapia cellulare è stata impiegata anche per il trattamento di altri agenti infettivi, come i poliomavirus (PyV) e l'HHV6. Benchè molto preliminari, le prime esperienze con cellule specifiche per BKPyV appaiono promettenti (14,27); nello studio di Tzannou et al condotto in riceventi un TCSE allogenico, 13 dei 14 pazienti trattati per cistite emorragica BKPyV-associata con cellule T multivirus-specifiche da donatore terza parte hanno mostrato una risoluzione completa dell'ematuria macroscopica entro 1-2 mesi (36). Dei due pazienti trattati per nefropatia virale, uno ha risposto al trattamento migliorando la funzione renale. Nel 50% dei pazienti trattati è stato osservato un aumento della risposta immunitaria specifica per BKPyV. I principali effetti collaterali sono stati la recidiva o la nuova insorgenza di GvHD (circa 16% dell’intera popolazione dello studio), l'idronefrosi transitoria e una diminuzione della funzione renale. Quest'ultimo evento, descritto in associazione a una concomitante infezione batterica delle vie urinarie, potrebbe essere stato dovuto anche alla lisi delle cellule infette nelle cellule tubulari renali. Quattro pazienti riportati in due studi, sono stati trattati per leucoencefalopatia multifocale progressiva da virus JC (JCPyV PML) (28). In un paziente pediatrico cui sono state somministrate cellule T specifiche per JCPyV da donatore, si è assistito alla ricostituzione dell'immunità virale specifica, alla clearance del DNA virale dal liquido cerebrospinale (CSF) e al controllo della malattia con un notevole miglioramento neurologico, in assenza di sindrome da immunoricostituzione. Altri tre pazienti sono stati invece trattati con cellule T BKPyV-specifiche allogeniche da terze parti, sulla base delle osservazioni riportate di un certo grado di reattività crociata tra PyV BK e JC a causa dell'elevata omologia (28). Uno dei 3 pazienti (TCSE da sangue cordonale) ha mostrato una risposta completa. Negli altri due pazienti, la carica virale è stata ridotta o eliminata nel CSF, determinando un netto miglioramento neurologico con deficit residuo in un caso e progressione di malattia nell'altro. Entrambi i pazienti hanno sviluppato una sindrome da immunoricostituzione. Due studi recenti condotti in 9 e 12 pazienti, rispettivamente, hanno confermato la sicurezza
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