554 utilizzati con successo per più di 20 anni. Questi vettori contengono un genoma di RNA che, una volta trascritto in doppio filamento, mediante trascrittasi inversa si integra nel genoma della cellula trasdotta. Vengono prese diverse precauzioni per garantire l'uso sicuro di tali vettori integrativi. Mentre i vettori retrovirali richiedono cellule attivamente in divisione per l'integrazione, i vettori lentivirali hanno la capacità di trasdurre cellule non in divisione o che proliferano lentamente e sono attualmente sempre più utilizzati per la modificazione genetica delle cellule T negli studi clinici. L’obiettivo biotecnologico è di ottenere virus ad alto titolo, frequenze di trasduzione sufficienti per la produzione di CAR-T preservando il fenotipo cellulare e le proprietà funzionali delle cellule T dopo la trasduzione rimangono una sfida. In alternativa ai vettori virali, l'ingegneria genetica basata su trasposoni non richiede una produzione di virus dispendiosa in termini di tempo e costi ed è sempre più considerata per la produzione clinica di cellule CAR-T. In contrasto con le tecnologie di stabile integrazione del DNA, il trasferimento di mRNA tramite elettroporazione o la trasfezione cationica lipido-mediata produce cellule T con transitoria espressione CAR per alcuni giorni [5] e dunque non è adeguata allo scopo di generare effettori antitumorali persistenti in vivo nel paziente nel medio e lungo termine. L'avvento delle tecnologie di editing del genoma permette non solo l’aggiunta del gene CAR ma anche la eliminazione o correzione di singoli geni rilevanti nelle funzioni delle cellule immunitarie, Applicato in modo efficiente nella modificazione delle cellule staminali ematopoietiche o mesenchimali per anni, l’editing nelle cellule T primarie è stato applicato solo recentemente con successo. Esempi di potenziali applicazioni cliniche sono il targeting dei geni per la morte cellulare programmata-1 (PD1) e altri recettori inibitori, catene α e β del recettore cellulare (TCR), CD52, antigeni dei leucociti umani (HLA) e β2-microglobulina (β2M). Una delle principali applicazioni dell'editing del genoma è la creazione di cellule CAR-T allogeniche "off-the-shelf" manipolate per evitare alcune limitazioni associate alle cellule T autologhe, come il processo di produzione personalizzato, le diverse settimane di tempo necessarie per la produzione e il rischio di fallimento della produzione. Tali CAR-T allogeniche sono ingegnerizzate con l’eliminazione del TCR locus e/o HLA dalla superficie delle cellule T, riducendo il rischio di reazione immunitaria verso i tessuti sani dell'ospite (GvHD) e di rigetto delle cellule stesse infuse da parte del sistema immunitario del paziente. Attualmente, la maggior parte di queste tecnologie di editing sono in fase di studio in modelli murini o in un numero molto limitato di pazienti, rendendo difficile trarre una conclusione definitiva in merito alla sicurezza e all'efficacia a lungo termine. Nel trattamento di pazienti con CAR-T è stata osservata la recidiva o la resistenza primaria all’effetto terapeutico immunologico delle cellule CAR-T. Lo studio biologico di questi pazienti ha permesso di evidenziare diversi meccanismi di resistenza che sono alla base di possibili interventi di miglioramento terapeutico. La perdita di antigene è il principale meccanismo e rappresenta l'adattamento definitivo di una cellula tumorale alla pressione selettiva di immunoterapia mirata. Mentre la down-regulation dell'antigene o l'espressione debole è un evento ben noto nel linfoma e nel mieloma trattati con anticorpi IgG, la perdita completa del target è un fenomeno che si verifica dopo la terapia basata su cellule CAR-T o nel coinvolgimento delle cellule T terapia con anticorpi bispecifici. Nei tumori maligni delle cellule B, la perdita di CD19 è stata osservata fino al 40% dei pazienti con Leucemia linfoblastica acuta a cellule B trattata con diversi prodotti CAR 19 [6]. Nel mieloma la down-regulation di BCMA è stata osservata in una percentuale significativa di pazienti dopo BCMA CAR-T. Oltre alla perdita di antigene, un certo numero di altri meccanismi limita o abroga il riconoscimento efficace delle cellule tumorali da parte delle cellule CAR-T. Nei modelli preclinici e nei tumori solidi, è stato dimostrato che le cellule CAR-T infiltranti il tumore subiscono una rapida perdita di funzionalità, limitando la loro efficacia terapeutica attraverso l'espressione di inibitori di superficie (PD1, LAG3, TIM3 e 2B4) [7]. Inoltre, in molti tumori ematologici, il microambiente tumorale del midollo osseo è noto per esaltare i meccanismi anti-apoptotici nelle cellule tumorali attraverso uno stretto cross-talk delle cellule stromali mesenchimali (MSC) e delle cellule tumorali, inibendo l’effetto immunoterapico anche dei CAR-T. 2. Il processo di produzione di CAR-T 2.1. La raccolta aferetica di linfociti (“Starting material”) La produzione di cellule CAR-T inizia da una raccolta aferetica di cellule mononucleate, anche se specificamente solo i linfociti T saranno utilizzati per la preparazione. Anche se sono in corso numerosi sviluppi clinici di cellule CAR-T allogeniche, attualmente solo terapie CAR-T autologhe sono approvate nell'Unione Europea. Le istituzioni centri CAR-T devono includere un servizio di aferesi in grado di garantire l'accesso a procedure di linfocitoaferesi in collegamento al programma CAR-T. La programmazione della raccolta aferetica di linfociti ad uso di produzione CAR-T deve rispondere ad essenziali requisiti organizzativi di coordinamento con il programma clinico complessivo del paziente e della catena di produzione. Vengono innanzitutto valutate le condizioni cliniche e biologiche del paziente, interrotti i trattamenti che possono ridurre il numero di cellule effettrici immunitarie la loro funzionalità. Sul piano organizzativo, i parametri di aferesi e la programmazione vengono stabiliti in base alle esigenze della produzione attraverso uno stretto coordinamento con l'impianto di lavorazione delle celle per garantire una spedizione regolare al sito produttivo, in conformità con le disposizioni specifiche del processo. Il centro di raccolta aferetica deve rispondere ai requisiti di Tissue Establishment e deve essere autorizzato dall’azienda produttrice attraverso un processo di qualifica specifico per ogni azienda produttrice, a garanzia della “Chain of Custody” e “Chain of Identity” del prodotto.
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