49 1. Aspetti Generali mendeliana ed espressi in maniera codominante. Ciò significa che un set di alleli HLA, chiamato aplotipo, è ereditato da ciascun genitore, e pertanto la probabilità che una coppia di fratelli condivida entrambi gli aplotipi parentali è del 25%. La regione genica dell’HLA è dotata di un tasso di ricombinazione, o crossing-over, relativamente alto, superiore all’1% [6]. Inoltre, alcuni alleli di differenti loci sono associati in maniera non casuale ed ereditati insieme, un fenomeno denominato linkage disequilibrium. Il numero di alleli HLA descritti è in continua crescita e, secondo il database IMGT/HLA, aggiornato ad aprile 2022 (versione 3.48.0), si contano 24308 alleli per l’HLA di classe I e 9182 alleli di classe II (IPD-IMGT/HLA database, release 3.48.0, 2022-04). 2.2. Struttura, funzioni e alloreattività Le molecole HLA sono eterodimeri di superficie, costituiti da due catene immunoglobuliniche α e β, di cui una soltanto reca la variabilità allelica. Le molecole HLA di classe I sono espresse su tutte le cellule nucleate e presentano peptidi di origine intracellulare. La catena pesante polimorfica α è codificata dai loci A, B e C, mentre il gene della catena leggera non polimorfica β mappa al di fuori dell’MHC, sul braccio lungo del cromosoma 15 [7]. La catena pesante α presenta tre domini variabili Ig-like, due dei quali formano la tasca di presentazione dell’antigene, mentre il terzo media l’interazione con il CD8, facilitando l’interazione con il T cell receptor (TCR) dei linfociti T citotossici, attivandoli. Le molecole HLA di classe II presentano peptidi di origine extracellulare e sono espresse soltanto sulle cellule presentanti l’antigene (APC), come macrofagi e cellule dendritiche, tuttavia, per effetto di citochine infiammatorie come INF-γ o il TNF-α, la loro espressione può estendersi ad altri tipi cellulari [8]. Sono costituite da due catene α e β di simile peso molecolare, entrambe codificate dall’MHC: la catena α non è polimorfica, mentre la catena β presenta un dominio Ig-like di presentazione dell’antigene e una regione di legame per il CD4 dei linfociti T helper, attivandone le funzioni regolatorie o helper citochine-mediate. Per alloreattività s’intende la capacità dei linfociti T di riconoscere il non-self. Questa si definisce diretta quando la risposta T, naïve o memory, è indirizzata verso i complessi allogenici HLA-peptide espressi sulla superficie di cellule allogeniche [9]; è indiretta, invece, la risposta T indirizzata verso peptidi derivati dalla degradazione delle stesse molecole HLA mismatched, presentate da cellule self [10]. Attraverso quest’ultima via, possono essere presentati anche antigeni HLA minori (mHAg), principalmente riconosciuti da cellule T naïve, che costituiscono il solo bersaglio di alloreattività nei trapianti full-matched [2]. Le cellule T alloreattive possono riconoscere le molecole HLA non-self sia in cellule sane che patologiche, mediando sia l’effetto terapeutico del trapianto, ovvero il controllo immunologico della patologia neoplastica residua (Graft versus Leukemia, GvL) sia l’attacco immune a tessuti sani (Graft versus Host, GvHD). 3. La tipizzazione HLA 3.1. Storia e nomenclatura L’osservazione che allo-antisieri provenienti da riceventi sensibilizzati lisavano alcuni ma non tutti i linfociti di vari donatori condusse all’individuazione dell’HLA come sistema antigenico sui globuli bianchi in grado di predire la compatibilità del trapianto [8]. Venne descritto inizialmente un repertorio limitato a circa 100 sierotipi. A partire dagli anni ’90, l’avvento delle metodiche di biologia molecolare applicate alla tipizzazione HLA rivelò un grado di polimorfismo molto maggiore [11] e richiese lo sviluppo di una nomenclatura molecolare [12]. Questa è caratterizzata da un asterisco (*) dopo la designazione del locus HLA, mancante nella nomenclatura sierologica, seguito da un numero di campi fino a un massimo di 4, che definiscono rispettivamente: il gruppo allelico, corrispondente agli epitopi sierologici (primo campo); il gruppo allelico che codifica per la stessa sequenza proteica per la regione di legame con l’antigene (secondo campo); la presenza di eventuali sostituzioni sinonime del DNA nella regione codificante (terzo campo); la presenza di differenze nella regione non codificante (quarto campo). Inoltre, può essere utilizzato un suffisso per descrivere i cambiamenti nel livello di espressione della molecola (Figura 1). Con il termine “tipizzazione a bassa risoluzione” ci si riferisce al primo campo, equivalente alla risoluzione sierologica, ottenibile sia con metodiche sierologiche che di biologia molecolare. La ”tipizzazione ad alta risoluzione”, ottenibile tradizionalmente con metodiche come il Sanger sequencing, si definisce come un set di alleli che condividono la specifica sequenza DNA del sito di legame con l’antigene (ADR) e corrisponde al secondo campo. L’ADR costituisce la porzione attiva della molecola di HLA e rappresenta, insieme alle regioni di legame per il CD4 e il CD8, la porzione maggiormente ipervariabile dell’intera sequenza genica. Le metodiche di Next Generation Sequencing (NGS) rendono possibile l’esecuzione di un grande numero di sequenziamenti clonali in parallelo [13]. Applicate al seFigure 1. Risoluzione della tipizzazione HLA. La tipizzaizone HLA ad alta risoluzione definisce la specifica sequenza nucleotidica del sito di legame con l’antigene. La risoluzione allelicaidentifica un singolo allele, definite come unica sequenza di DNA per il gene HLA. (Nunes E. et al, Blood 2011)
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